单抗制备常见问题分析

单抗制备常见问题分析
1.  为什么我的细胞生长很慢？
答：可能的原因：
（1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。
（2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。
（3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面第二个问题。
（4）其它问题，可以参考本页面第二个问题。
2.  为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？
答：可以从这几个方面考虑：
（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。
（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。
（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。
（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。
（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。
（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。
（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。
（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。
（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。
3.  为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？
答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。 对于冻存过程，需要注意：
（1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目前认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培养基，不管是哪一种，冻存保护剂DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。如果使用第二个配方，注意一定要用养过杂交瘤的培养基，而尽量不要用一般的*培养基，而且一定是配养需要冻存的那一株的培养基。文献中也有提到用甘油作为冻存保护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。如果新手确实对这个没把握，上也有商品化的冻存液，买回来按照说明书操作就OK了。
（2）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在DMSO存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。
（3）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1 ℃的速度下降冻存细胞是的。如果条件简易，可以把细胞放在4 ℃半小时左右，然后再在-20 ℃放置1-2小时，后转入-80 ℃放置一晚上，终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。现在上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80 ℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。
（4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很容易进入冻存管。这一点很多人都没有注意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，终可能造成细胞污染。
（5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。
4.  为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？

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