比色法和分光光度法的基本知识

一、 光的特性

光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示：

　　λ＝C/V 

　　式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。Ｃ为光速等于299770千米／秒。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1-1所示的波谱图。 分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之间。其中200nm－400nm为紫外光区，400nm－760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。

二、光的互补色

假如两种色光 ( 单色光或复色光 ) 以适当地比例混合而能产生白色感觉时，则这两种颜色就称为“互为补色”。 非发光物体的颜色 ( 如颜料 ) ，主要取决于它对外来光线的吸收和反射，所以该物的颜色与照射光有关。一般把物体在白昼光照射下所呈现的颜色称为该物体的颜色。如果将白昼光照射在黄蓝两种颜色混合后的表面时．因黄颜料能反射白光中的红、橙、黄和绿四种色光，而蓝色光能吸收其中的红、橙和黄三种色光，结果使混合颜料显示绿色。这种颜色的混合与色光的加色混合不同，

三、光的选择性吸收

物质对光的吸收是物质和光能相互作用的一种形式。由于光的波粒二象性只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被吸收，而物质的基态和激发态是由物质的原子结成和原子间相互作用决定的，不同的物质的能态不同，对光的选择性吸收也就不一样。所以物质对光具有选择吸收性。
　　要研究光的选择性吸收，首先必须搞清楚其产生的机理。
　　原子是由质子和核外电子组成的，核外电子以不同速度在质子周围不同轨道上旋转，每个轨道的能级是不一样的。如同卫星围绕地球转的情况是相似的。同时，每个轨道又有方向不同的亚轨道，而同一轨道的不同亚轨上的能量也是不相同的。当电子的运动轨道改变都会伴有吸收和释放能量。所以不同的能量变化有不同的吸收光谱。分子的情况较为复杂，除了电子的跃迁外还有分子的转动和振动跃迁、分子中原子的转动和振动跃迁。详细情况如1图所示：
当某一光线和某一能级差相同时就会发生特异性吸收。因此不同的物质有不同的吸收光谱。
　　分光光度法对物质的定量分析，就是建立物质对光的选择性吸收与物质本身物性有关基础上，从而能在适当的情况下，可以不进行分离就在混合物中进行单组分或多组分的测定。
　　在实际定量分析中，待分析物一般都是混合物，其中以溶液为主。因此，溶剂效应对物质吸收带影响是个很重要的问题，特别是紫外区的吸光谱。溶液中的吸收光谱和物质气态光谱是不同的，在非极性溶剂中所得的光谱接近于气态光谱。而极性溶剂对溶质吸收光谱的影响极大。下图可以明显显示出溶剂效应，庚烷极性小，其吸收光谱改变少，而乙醇极性大，吸收光谱产生了重要改变。这点对临床检验工作有重要影响。例如：NADH是检验工作中常用的底物，要计算K值时要用水溶液的吸光系数，而不要用其他体系的吸光系数。

小结：

一、 光的特性

二、光的互补色

三、光的选择性吸收